本制品是一种利用荧光探针MitoSOX Red检测3D培养的细胞球或类器官中线粒体内超氧化物变化的试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地检测3D培养的细胞球或类器官中线粒体内超氧化物变化。仅需染色15分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官中线粒体超氧化物红色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。
超氧化物通常指超氧化物阴离子O2-·，是一种氧分子的自由基。在呼吸链中，NADPH氧化酶把电子传递给氧分子的时候，就会产生超氧化物阴离子O2-·。超氧化物阴离子O2-·是一种强氧化剂，可以由被刺激的白细胞等产生，从而抵御微生物的感染等。超氧化物阴离子O2-·也可以导致氧化损伤，和许多疾病的发生密切相关。
MitoSOX Red，简称MSR，也称MitoSo、MitoROS、Mito-HE，分子量为759.7，分子式为C43H43IN3P，是一种新型的用于线粒体内超氧化物检测的荧光探针，其可快速、特异性地靶向线粒体，从而有选择性地检测线粒体内的超氧化物。MitoSOX Red是带有阳离子三苯基磷酸基团的二氢乙锭衍生物。二氢乙锭可以被活性物质(如超氧化物)氧化为乙锭，然后与DNA结合产生荧光。MitoSOX Red显示出同样的特性，可被超氧化物迅速氧化，但不被其它活性氧(ROS)和活性氮(RNS)氧化，氧化产物结合核酸后，产生强荧光。
MitoSOX Red的磷酸基团上的正电荷被三个亲脂苯基包围，从而有助于其进入活细胞并选择性地靶向进入线粒体，最终可以被超氧化物氧化。被氧化的MitoSOX Red与线粒体内核酸结合，产生强烈的红色荧光，MitoSOX Red有两个激发峰，分别约为396nm和510nm，发射波长约为580nm。396nm的激发峰在其它活性氧(ROS)产生的乙锭类氧化产物的激发光谱中不存在，因此选择在396nm进行激发，可能对于线粒体超氧化物的检测更为特异。
本试剂盒提供的MitoSOX Red为1000×储存液。本试剂盒推荐的最终使用浓度经过优化，对大多数细胞都适用，但为了得到更满意的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，MitoSOX Red的终浓度通常为0.2～1×，最优先的推荐终浓度为1×。过量MitoSOX Red在线粒体积累会造成细胞损伤，因此MitoSOX Red的工作浓度通常不能超过1×，否则可能会产生细胞毒性，例如改变线粒体形态，MitoSOX Red重新分布到胞核或胞质中等。
本试剂盒组分齐全，使用方便。本试剂盒提供了By3D mSoxUp作为诱导细胞线粒体内超氧化物生成的阳性对照，终浓度通常为0.5～2×，最优先的推荐终浓度为1×。本试剂盒同时提供了By3D MitoSOX Red Assay Buffer，使用更便捷，通常可以确保获得更稳定可靠的检测效果。
- 适用范围广：本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
- 使用便捷：整个检测过程仅需约30分钟即可完成。3D细胞球经线粒体超氧化物阳性对照试剂By3D mSoxUp等诱导处理后，将本试剂盒中的By3D MitoSOX Red (1000×)按照相应比例用By3D MitoSOX Red Assay Buffer配制成By3D MitoSOX Red检测工作液，避光孵育15分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。
| 组分 | 200T | 1000T |
| By3D MitoSOX Red (1000×) | 20μL | 100μL |
| By3D mSoxUp (500×) | 20μL | 100μL |
| By3D MitoSOX Red Assay Buffer | 20mL | 100mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- BSA和酚红对本荧光探针的检测有干扰，需避免。
- MitoSOX Red在与超氧化物反应后可能会重新分布，并与线粒体或细胞核DNA结合，因此可以观察到红色荧光集中在细胞核。
- 本试剂盒仅限于进行存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。
- 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
- 第一次使用时请分装成小包装后-20℃保存，以避免反复冻融。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经线粒体超氧化物诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
- 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
- 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。如果后续用于荧光酶标仪检测，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
- 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
- 3D细胞MitoSOX Red检测工作液的配制：
- By3D MitoSOX Red检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D MitoSOX Red检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- By3D MitoSOX Red检测工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D MitoSOX Red检测工作液的量，用By3D MitoSOX Red Assay Buffer配制适量的By3D MitoSOX Red检测工作液。
样品数量 10个样品 50个样品 100个样品 By3D MitoSOX Red (1000×) 20μL 100μL 200μL By3D MitoSOX Red Assay Buffer 1mL 5mL 10mL By3D MitoSOX Red检测工作液 ~1mL ~5mL ~10mL - 配制By3D MitoSOX Red检测工作液时注意避光，且需现配现用，稀释后不能长期保存。
- By3D MitoSOX Red检测工作液中By3D MitoSOX Red的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。By3D MitoSOX Red的初始推荐工作浓度为1×，可以在0.2～1×范围内摸索最佳工作浓度。如果阳性对照的染色偏弱，可以适当提高浓度；如果背景染色偏强，可以适当降低浓度。对于特定细胞的检测，建议先进行预实验。
- By3D MitoSOX Red检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D MitoSOX Red检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 阳性对照的设置：把试剂盒中提供的By3D mSoxUp (500×)推荐按照1:500的比例加入到无血清细胞培养液中，处理细胞20分钟。随后按照下述方法加入By3D MitoSOX Red检测工作液，进行线粒体内超氧化物的检测。对于大多数细胞，通常By3D mSoxUp(1×)处理20分钟后超氧化物含量大量增加，By3D MitoSOX Red染色后观察应呈现较强的红色荧光；而正常的细胞经By3D MitoSOX Red染色后应呈现微弱的红色荧光。对于特定的细胞，By3D mSoxUp作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度作用时间，甚至某些细胞可能对By3D mSoxUp不敏感。
- 3D细胞MitoSOX Red的染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μL By3D MitoSOX Red检测工作液。细胞培养箱中37℃孵育15分钟，不同的细胞最佳孵育时间不同。以15分钟作为初始孵育时间，根据作用细胞对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
- 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光检测：
- 参数设置：MitoSOX Red和超氧化物反应产物的荧光光谱，如果用于共聚焦显微镜检测，可以使用396nm激发波长、610nm发射波长进行检测，对于超氧化物的检测更精准，可以实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。对于普通的荧光显微镜，也可以使用510nm激发波长、580nm发射波长进行检测，但可能也可以检测到其它的活性氧。
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测。通过对比对照组荧光探针的RFU，可以计算出细胞球内线粒体超氧化物的相对比例关系。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 参数设置：MitoSOX Red和超氧化物反应产物的荧光光谱，如果用于共聚焦显微镜检测，可以使用396nm激发波长、610nm发射波长进行检测，对于超氧化物的检测更精准，可以实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。对于普通的荧光显微镜，也可以使用510nm激发波长、580nm发射波长进行检测，但可能也可以检测到其它的活性氧。
- 其他说明：
上述推荐的By3D MitoSOX Red的初始工作浓度为1×，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000的比例稀释By3D MitoSOX Red，使装载探针时MitoSOX Red的浓度降低。另外，探针装载的时间也可以根据情况适当进行调整。
图1.本试剂盒对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养72小时，1×By3D mSoxUp诱导细胞球20分钟，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D MitoSOX Red检测工作液，染色15分钟(图中各染料可混合配制后使用)。结果显示，本试剂盒对于By3D mSoxUp (mSoxUp)诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，By3D MitoSOX Red染色的对照组细胞无明显阳性染色(B、G)，使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂By3D mSoxUp处理后，线粒体内超氧化物生成增加，MitoSOX Red与超氧化物反应并重新分布，与线粒体及细胞核DNA结合，细胞中线粒体及细胞核的红色荧光显著增强[7]。By3D Mito-Tracker Green染色的线粒体(C、H)和By3D Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(D、I)。By3D Mito-Tracker Green染色液和3D细胞Hoechst 33342染色液需自备。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。
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